EPATITE C: LO SVILUPPO DEGLI INIBITORI DI NS3/4A (LA COSTRUZIONE DELLA CATTEDRALE)

"Macrociclizzazione.

Esperimenti di risonanza magnetica nucleare avevano indicato che i peptidi di questa serie si distendevano in una configurazione ben definita (P1-P4), e che le catene laterali P3 e P1 stavano in prossimità l'una dell'altra (si parla del complesso legante-proteina, NdCS). Fu ipotizzato che la penalità entropica della complessazione con la proteasi potesse essere ridotta prearrangiandando la conformazione biologicamente attiva. Quindi le catene laterali P3 e P1 vennero connesse, creando un inibitore macrociclico."

E di nuovo notate che ciluprevir fu mollato a causa della sua tossicità in vivo. Ma ha funzionato da proof of concept. L'invenzione dell'inibitore macrociclico avvenne in Boheringer, dove erano partiti dagli inibitori non ciclizzati (sviluppati da Merck e Vertex) .Altri, in altre aziende, partirono dal macrociclo Boheringer, e nel gioco delle lead optimization alla fine, come abbiamo visto, AbbVie ha avuto la meglio con Mavyret.
L'analogia con la costruzione di una cattedrale gotica è abbastanza calzante, solo che qua (come in tante altre storie della chimica medicinale) il progetto finale veniva definito dalle singole intuizioni raggiunte e dai singoli dettagli realizzati in corso d'opera. E come spesso succede, alla fine, non è stata premiata l'intuizione chiave, ma la molecola che meglio si è comportata nell'uomo (cosa assolutamente imprevedebile a priori). Il che dimostra, ancora una volta, che quanti parlano di farmaci "me too", o di "conoscenze di pubblico dominio usate per profitti industriali" non sanno quel che dicono: in questo campo un atomo di carbonio in più, o in meno, nel punto giusto, può fare una differenza immensa.
Gli "skilled in the art" avranno piacere a leggersi la storia dall'inizio alla fine nella review del link.

https://www.diva-portal.org/smash/get/diva2:787019/FULLTEXT01.pdf

 

Detto ciò, una nota. Il drug development è in generale un campo multisciplinare, dove sono coinvolte chimica, biologia e medicina. Se dei biologi non avessero individuato, purificato e messo su saggi di inibizione di NS3/4A, i chimici non avrebbero avuto un bersaglio, né mezzi per valutare il proprio lavoro, cioè l'attività di quel che veniva sintetizzato. Senza ricercatori clinici non si sarebbe trovato il dosaggio ottimale e quindi il risultato dei trial clinici. Quindi tra i costruttori della cattedrale ci sono anche biologi e medici.

DIETA E TUMORI - POLIFENOLI DEL TE' VERDE

E' ovvio che pensare di curare questo o quel tumore con la dieta sia idiota (e che proporlo sia criminale). Da qui a liquidare l'argomento alimenti chemoprotettivi scagliandosi contro chiunque lo affronti (se pur in modo improprio) o per esempio faccia un nome ("curcuma", tipicamente) ce ne corre.
"The medicinal chemistry of Anticancer Drugs" (C.Avendano, J.C. Menendez, Elsevier, 2008) ha l'ultimo capitolo dedicato al controverso tema della chemoprevenzione, che però include anche esempi tutt'altro che controversi di chemoprotettivi presenti in alcuni cibi. Cominciamo dal tè verde:

"I polifenoli del tè verde (epicatechina gallato e epigallocatechina gallato, p.e.) sono potenti scavenger di radicali che sono stati estensivamente studiati come agenti chemopreventivi. In questo caso la stabilizzazione del radicale fenolico è dovuta all'estensiva delocalizzazione dell'elettrone spaiato sull'anello aromatico e sul sostituente p-acilico, e anche all'ingombro sterico dei vicini ossidrili. Uno studio clinico di fase due ha studiato la modulazione da parte di queste sostanze dell'escrezione urinaria di 8-idrossideossiguanosina (8-OHdG), un biomarker del danno ossidativo del DNA. I risultati ottenuti suggeriscono che la chemoprevenzione con polifenoli del tè verde sia efficace nel diminuire il danno ossidativo al DNA."

CONTI SBALLATI E BALLE SEMPLICI (vaccini e aspirina)

L'epidemiologo organico si getta contro la campagna su reazioni avverse e segnalazioni. (https://www.facebook.com/PLopalcoPublic/posts/513921238990304)
E con buona ragione, 21.658 reazioni avverse segnalate nel biennio 2014-2015 non ci sono. Ma non ci sono neanche le 12.645 che dice il professore. Tabella pagina 31 del report nella forma breve: Vaccini Batterici, 2271 segnalazioni nel '14, 2282 nel '15; Vaccini Virali, 8549 segnalazioni nel '14, 1586 segnalazioni nel '15. Totale: 14.688.

Altro particolare non trascurabile: "Comunque aspirina e tachipirina producono più segnalazioni di qualsiasi singolo vaccino", dice l'epidemiologo. Mah. Fermo restando che AIFA raccoglie più segnalazioni su farmaci che su vaccini (e il discorso segnalazioni andrebbe approfondito, e non poco), sullo stesso rapporto, alla stessa pagina, stessa tabella, si registrano per i vaccini morbillosi  5.217 segnalazioni nel '14, 596 nel '15. Per la tachipirina invece dal 2002 ad oggi sono state registrate 3.415 segnalazioni, in Italia. Dal 2002 ad oggi (Fonte: Eudravigilance, ultima release). Ah, per l'aspirina 8.363 segnalazioni in Italia. Sempre dal 2002 a oggi. Stessa fonte. Il solo consumo di cardioaspirina, per dare un'idea, è di circa dieci milioni di compresse all'anno. Quindi, minor numero di segnazioni a fronte di maggior consumo/somministrazione.

DIETA E TUMORI - LE CRUCIFERE, SENAPE INCLUSA

(Dove, a scanso di equivoci, si continua a parlare di chemoprotezione, ovvero di prevenzione)

Quando si parla di crucifere di solito si parla di glucosinolati e mirosinasi, che vengono in contatto quando la pianta è danneggiata, producendo sulforafano.
Ma le crucifere contengono anche 1,2-ditiolo-3-tioni. L'attività chemoprotettiva di questi composti sarebbe correlata allo stimolo del metabolismo di fase due, il principale pathway di eliminazione degli xenobiotici (o se vogliamo usare la parola che crea così tanto scandalo di questi tempi, la detossificazione). Studi su un'analogo sintetico, l'Oltipraz, un agente sviluppato come antielmintico, hanno verificato che questa classe di composti stimola la produzione di GST (glutatione-S-trasferasi), che è l'enzima che si occupa di "attaccare" una molecola di glutatione agli xenobiotici elettrofilici, tra cui ci sono per esempio i prodotti ossidativi del metabolismo di fase I delle aflatossine (epossidi) e altri metaboliti cancerogeni. Una volta che l'"estraneo" è stato coniugato al glutatione, è inattivato e "taggato" per l'eleminazione via escrezione.
Considerata la stabilità media della classe di composti, questi dovrebbero resistere quanto basta a trattamenti termici prolungati (cottura)
Torniamo ai glucosinolati. Principalmente si parla di glucorafanina, trasformata dalla mirosinasi (sempre presente nella pianta, ma in cellule diverse, che la rilasciano in seguito a stress meccanico) in sulforafano. E quindi stiamo parlando di quella frazione solforata che viene distrutta/ossidata durante la cottura. Quindi, se parliamo di alimenti, i benifici esistono solo in caso di insalata di cavolo crauto (detto anche cappuccio) e probabilmente anche nei crauti propriamente detti. E nella senape (il che forse spiegherebbe qualcosa sul fatto che le abitudini alimentari dei tedeschi non conducano a un numero incredibile di esiti nefasti sulla loro salute). E questo alla faccia di chi ha fatto questioni di principio sulle manie crudiste dicendo "meglio cotto comunque".
La glucorafanina ha senso come integratore alimentare puro? A regola no, visto che manca l'attivazione della mirosinasi. Il sulforafano invece? Forse. Anche lui come i 1,2-ditiolo-3-tioni, eserciterebbe la sua azione potenziando l'attività del metabolismo di fase due, ma non esistono ad oggi evidenze cliniche di precisi benefici. Quindi, meglio insalata di cavolo. Saltando di ortaggio in ortaggio, il sulforafano è parente strettissimo della rafanina, contenuta in broccoli, cavolo rosso ma soprattutto nei ravanelli. La rafanina esula dal discorso chemoprotettivi: ha proprietà antivirali ed antibatteriche. Isolata manifesta una tossicità troppo alta per l'uso terapeutico, ma le proprietà antiinfettive e antimicotiche dei ravanelli erano ben note alla medicina tradizionale cinese.

Effetti collaterali delle crucifere sono noti da tempo e messi nero su bianco nel XIX secolo da Pellegrino Artusi (L'arte del mangiar bene), che parlando del cavolfiore lo definisce "il re dei venti".

Fonte prevalente anche stavolta "The medicinal chemistry of Anticancer Drugs" (C.Avendano, J.C. Menendez, Elsevier, 2008)

ONCOLOGIA, DALLA PROSPETTIVA DEL LABORATORIO: OSIMERTINIB

Interessante articolo su come sono stati gestiti dal lato clinico gli inibitori di EGFR per i tumori del polmone.
https://www.facebook.com/roberta.villa.94/posts/10211998588340193

EGFR è una chinasi, uno dei più famosi target oncologici assieme a VEGFR (altro fattore di crescita, altra chinasi). EGFR fu scoperto da Stanley Cohen, che per questo prese il Nobel assieme alla Montalcini (che aveva scoperto un altro fattore di crescita), ed è passata una trentina d'anni.
Quindi un inibitore EGFR ( o VEGFR) non sarebbe una novità eclatante (ce ne sono in giro da più di quindici anni, tra piccole molecole e anticorpi). Ma osimertinib, approvato ad Astra Zeneca nel 2015, è un rappresentante dell'ultima generazione: inibitori covalenti di chinasi.
Vedete quella codina, il gruppo più in basso nella formula qua sotto? E' la "testata". E' un'acrilammide, e quindi un accettore di Michael. Il che significa che prende nucleofili presenti sui residui degli amminoacidi di una proteina e ci si lega con un legame covalente. E questo è uno dei motivi per cui fino a pochi anni fa davanti agli accettori di Michael si avevano perlopiù reazioni scomposte. Sunitib stava per essere scaricato nell'immondizia, dopo che Pfizer comprò la Sugen, perché a qualcuno sembrava che potesse avere un carattere di accettore di Michael.
Poi però davanti ai risultati preclinici di composti del genere ci si è dovuti arrendere all'evidenza: se la molecola è costruita nel modo giusto, riesce ad essere selettiva.
E osimertinib è selettivo, perché il resto della molecola è costruito come una chiave per una specifica serratura. La serratura è il sito catalitico della proteina (EGFR, in questo caso), costruito dall'evoluzione per coordinare una molecola di ATP. Osimertinib grazie alla sua struttura trova la "serratura" e con la "testata" ne blocca irreversibilmente l'ingranaggio (precisamente "catturando" lo zolfo della cisteina C797 di EGFR). Qual'è la sua utilità? E' con la mutazione T70M che caratterizza in molti casi le cellule tumorali che hanno acquisito resistenza agli inibitori di vecchia generazione
(e la resistenza a osimertinib si sviluppa ovviamente con mutazioni di C797).
Per cui il suo uso è diretto ai tumori che presentano questa specifica mutazione, T70Mm, che deve essere verificata prima del trattamento. E di questo e simili parlano i medici intervistati da Roberta Villa.

L'ATTIVITA' DELLA TRASCRITTASI INVERSA IN MPR E ALTRO: UN EXCURSUS STORICO

Sempre su segnalazione di Joe di Baggio, un' interessante review storica sul problema della contaminazioni virali e retrovirali nei vaccini. E' lungo e ben articolato ma, per ricollegarsi al post di ieri, riassumo in breve su MPR e sospetti di retrovirus.
Nel 1995 viene trovata attività di trascrittasi inversa (da ora in poi RT) nei vaccini MPR. Il che fa sospettare contaminazione da retrovirus ignoto con ignoto impatto sulla pubblica salute. Il punto è nel metodo. All'università di Zurigo mettono a punto un protocollo di altissima sensibilità per rilevare RT, il protocollo PERT. E si cominciano a trovare tracce di RT dove prima non se ne vedevano. Viene messa sotto la lente di ingrandimento la linea cellulare di pollo che viene usata per la produzione di MPR e si trovano le medesime tracce. Per MPR si usa pure una linea cellulare umana e lì nessuna traccia. Nell'antiinfluenzale prodotto con le uova, nemmeno.
A questo punto si sono mosse FDA e WHO e tutti cercano di capirci qualcosa. Se si levano di mezzo le cellule di pollo non c'è abbastanza MPR per supportare i programmi di immunizzazione in corso, quindi considerando che da un punto di vista epidemiologico non ci sono segnali preoccupanti, si continua ad indagare. E quello che viene fuori, nel tempo, è che quella bassissima attività di RT rilevata è endogena, ovvero prodotta dalle stesse cellule di pollo - il pollo come altre specie presenta nel proprio DNA sequenze retrovirali rimaste lì in centinaia di migliaia di anni di evoluzione. E traduco la parte finale della sezione, "Lesson learned":
"Nel trattare con possibili contaminazioni virali dei vaccini in commercio, la verifica scientifica delle evidenze riportate, la valutazione del rischio e varie possibili opzioni di azione hanno bisogno di un veloce input da parte degli esperti, e i risultati devono essere trasparenti. Quando sono coinvolti vaccini di importanza globale, i benefici della discussione a livello internazionale, della condivisione di informazione, e della cooperazione durante tutto il processo sono di immensa importanza.
Quando vengono sviluppati nuovi metodi per la rilevazione di agenti avventizi (contaminanti biologici, NdCS), questi devono essere valutati dal punto di vista della specificità. In questo caso il nuovo metodo stava rilevando un marker di retrovirus endogeni, elementi LINE, e anche polimerasi cellulari, invece che un retrovirus infettivo. Le informazioni sulla performance di ogni nuovo test devono essere disponibili prima dell'applicazione di questi test a vaccini, substrati cellulari e materie prime al fine di evitare interpretazioni errate e sopravvalutazione dei risultati dei test"

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1045105614000748

COLCHICUM, COLCHICINA, TIOCOLCHICOSIDE

La tubulina è una proteina dimerica che polimerizzando costistuisce i microtubuli, filamenti intracellulari di una certa importanza, anche perché durante la mitosi formano il fuso mitotico.
I dimeri di tubulina sono in costante equilibrio dinamico coi microtubuli. Bloccare l'equilibrio da una parte o dall'altra (inibire la polimerizzazione o stabilizzare il microtubulo) provoca l'arrestamento della mitosi alla transizione metafase/anafase, portando alla morte della cellula. Stabilizzatori e destabilizzatori di microtubulo, in quanto antimitotici, sono stati quindi sviluppati come antitumorali. Ne esistono tre classi, che si legano a siti diversi della tubulina. Ci sono il sito della vinca, il sito dei tassani, e il sito della colchicina. Ma la colchicina, pur avendo avuto un gran ruolo negli studi sulla mitosi, non è stata usata come antitumorale, se non in veterinaria.
E' l'alcaloide che rende tossico il colchico, e il suo uso non è precisamente una cosa recente.
L'estratto di colchico è citato nel papiro Ebers (Egitto, 1500 AC) come antireumatico. Dioscoride, I sec, in De Materia Medica, lo cita come rimedio per la gotta. L'uso dell'estratto di colchico continua nei secoli ma solo nel 1833 si arriva alla purificazione dell'alcaloide, battezzato colchicina da Geiger, il chimico che lo cristallizzò. Ma per arrivare a determinarne la struttura si dovettero attendere gli anni 50 del secolo scorso.
L'effetto anti gotta della colchicina è comunque dovuto alla sua affinità per la tubulina (la depolimerizza ad alte concentrazioni, mentre a basse concentrazioni stabilizza i microtubuli). Questo deprime la motilità dei neutrofili con effetto antiinfiammatorio.
La storia della colchicina una decina di anni fa incrocia la Unapproved Drug Initiative: ci sono in giro farmaci vecchissimi, che non sono mai stati sottoposti ai test e ai trial richiesti dai farmaci moderni. Le agenzie federali americane non hanno soldi per recuperare i prodotti di reale utilità finanziando i trial, e così offrono incentivi ai privati. E nel 2009 URL, una piccola farmaceutica di Philadelphia, presenta una NDA (New Drug Application) per la colchicina. Il farmaco viene approvato e il prezzo di una compressa sale da 9 cent a quasi 5 dollari. Poi nel 2012 arriva Takeda che compra URL e  il prezzo sale ancora.
Come vedete dalle formule esiste un'altro alcaloide parente stretto della colchicina, la tiocolchicina. Poche differenze, uno zolfo al posto di un ossigeno. E infatti l'attività è all'incirca la stessa, ma la tiocolchicina è più nota per il suo 3-O-glucoside, meglio noto come tiocolchicoside. Con il glucosio attaccato cambia tutto. I glicosidi sono abbondanti nelle specie vegetali, e quelli che hanno attività farmacologica spesso la devono all'aglicone (ovvero alla molecola senza lo zucchero attaccato), che si forma durante il metabolismo del composto - esempio classico tra i classici, la salicina. Ma nel caso del tiocolchicoside il glucosio fa parte del cosiddetto "farmacoforo".
Il 3-O-glicoside della tiocochicina è un antagonista GABAA, del recettore della glicina, di nAChRs -  un rilassante della muscolatura striata, il muscoril. Utile in quelle situazioni traumatiche in cui la contrattura muscolare, che sarebbe un meccanismo di difesa dell'organismo, diventa un problema serio e debilitante. Ma come già accennato nel nostro corredo enzimatico (e in quello della nostra flora intestinale) ci sono glucosidasi e glucositrasferasi, cioè enzimi che si preoccupano di staccare molecole di glucosio (ed eventualmente trasferirle altrove). E quindi il principale metabolita del muscoril è la 3-O-demetiltiocolchicina, che essendo praticamente tiocolchicina esercita la propria attività citotossica. Per questo per compresse o infusione il muscoril può essere somministrato solo per pochi giorni, mentre con pomate e simili le cose vanno molto meglio.